Preimplantační genetická diagnostika

Soubor těchto specializovaných vyšetřovacích metod je úzce spjat s principy in vitro fertilizace (IVF) a nebo intracytoplasmatické injekce spermii (ISCI). Vyšetření nelze provést bez asistované reprodukce. Jedná se o genetický test jedné nebo dvou embryonálních buněk. Vyšetření se provádí na interfázních jádrech geonomu (to znamená na jádrech, které se právě nemnoží). V České republice se tento princip používá od roku 2000. Díky unikátnímu propojení genetického vyšetření a kontroly vývoje zárodku dojde k přenosu embrya, ze kterého se s největší pravděpodobnosti vyvine zdravý potomek. V některých zemích se provádí preimplantační diagnostika z pólového tělíska vajíčka, ale tato metoda má diagnostické limity, a proto se běžně nepoužívá. Do praxe přešla pouze ve státech, kde legislativa neumožňuje manipulaci s buňkami embrya.

Co všechno lze pomocí preimplantační diagnostiky zjistit?

V dnešní době se díky genovému výzkumu dá přečíst celý genom embrya. Tento zásah by byl ovšem neetický, proto se při genetickém vyšetření omezujeme na nejzávažnější, nejčastější nebo nejpravděpodobnější choroby, kterými by mohlo být embryo zatíženo. Mnoho genetických mutací vede k časným potratům během prvního trimestru těhotenství, preimplantační diagnostika těmto ztrátám pomáhá předcházet. Pravidelně se zkoumají chromosomové vady (Downův syndrom, Edwardsův syndrom a Pataův syndrom) nebo genové mutace (jako jsou například mutace způsobující cystickou fibrózu, talasemii, syndrom fragilního X, srpkovitou anemii, fenylketonurii, hemofilii, Alportův syndrom nebo mutace tumor supresorového genu p 53 a neurofibromatózu typu I a další.) Někdy se také stanovuje pohlaví dítěte u rodičů, kde matka je přenašečka onemocnění projevujícího se pouze u chlapců (hemofilie A a B, daltonismus, ektodermální dysplázie, syndrom fragilního X)

Postup

Při preimplatační diagnostice se odebírá jedna nebo dvě buňky ze 3 denního embrya. Embryo by mělo být 8-10 buněčné. K tomu je nutné, aby laboratoř byla vybavena tak zvaným mikromanipulátorem. To je přístroj, který převádí poměrně hrubé pohyby ruky na jemné miniaturní pohyby. V souvislostí s velikostí vajíčka (0,1mm) by i velmi jemný pohyb byl značně nešetrný, a proto pokud pohne embryolog rukou zhruba o 10 cm, mikromanipulátor přenese tento pohyb na posunutí o 1mm. Do tohoto přístroje se upevní držící pipeta (skleněná trubička s kónusem o průměru 0,1mm). Tou se přidržuje vajíčko. Menší manipulační pipeta (s kónusem o průměru 0,01 mm) se vpraví do 8-10 buněčného vajíčka a pomocí jejího sání se odsaje jedna buňka. Poté se mikropipeta vyndá a nasáté vajíčko přemístí buď na podložní sklíčko, které je určeno pro metodu FISH a nebo do mikrozkumavky, kde se připraví pro PCR.

Cytogenetické vyšetření: Patří mezi základní a nejstarší principy genetického vyšetření. Odhalí vady jako jsou nadbytečné chromozomy a velké změny ve strukturách chromozomu. Nevýhoda je, že tato mikroskopová metoda nemůže dostatečně rozlišit některé malé změny chromozomu nebo vyvážené přesuny částí chromozomů mezi sebou. Cytogenetické vyšetření mohou podstoupit  rodiče a podle výsledů se dá určit z jakou pravděpodobností zplodí daný pár zdravé dítě. Toto vyšetření se provádí vždy u dárce spermatu nebo vajíčka a také u rodičů, kteří mají již jedno postižené dítě, nebo potratili dítě, u kterého se nějaká genetická vada prokázala. Při proceduře speciálně obarvíme chromozomy a dostaneme mikroskopický obraz takzvaného proužkovaného chromozomu. Jednotlivé proužky zkušenému cytogenetikovi pomohou odhalit nesrovnalosti v morfologickém tvaru chromozomů. Kromě tvarových odchylek je nutné spočítat a seřadit jednotlivé chromozomy. Normální výsledek se zapisuje jako karyotyp 46+XY jedná-li se o muže  anebo 46+XX jedná-li se o ženu.  Toto klasické cytogenetické vyšetření je dnes v indikovaných případech nahrazeno metodou FISH

FISH (Fluorescenční in situs hybridizace): Při této metodě potřebujeme mít testovanou buňku na podložním mikroskopickém sklíčku. Poté se aplikují genové sondy s fluorescenčním barvivem. Tyto sondy jsou specifické pro určitou část genomu a jedině na ty se dokáže navázat. Například existuje sonda pro chromozom X, pro chromozom Y, pro 21., 18., 16., 13., chromozom. Ty nám pomohou odhalit některé závažné chromosomové vady jako je například Downův syndrom. Dále můžeme testovat nemoci, které se vyznačují specifickou genovou mutaci jako je například cystická fibróza. Dále také díky sondám pro sex chromozomy X a Y dokážeme stanovit pohlaví embrya. Což může být velmi důležité pro diagnostiku nemocí typických přenosem jen na jedno pohlaví. Po aplikaci těchto sond podložní sklíčko promyjeme roztokem, aby se sondy, které se nenavázali pevně na DNA vymyly. Tyto sondy mohou být více barevné, a proto můžeme sledovat několik genů zároveň. Vzorek poté hodnotíme pod fluorescenčním mikroskopem, kde se sondy jeví výrazným barevným fluorescenčním zářením.

PCR (Polymerová řetězová reakce): Pro tuto reakci musíme buňku umístit do mikrozkumavky. Pomocí enzymů, které jsou podobné enzymům v lidských buňkách, nejprve rozpleteme dvoušroubovici DNA. Poté pomocí komerčně prodávaných primerů (část DNA se specifickou strukturou) namnožíme úseky DNA, které právě touto specifickou strukturou začínají. Poté mikropipetou aplikujeme obsah zkumavky do předem připravené jamky v gelu na elektrické desce. Deskou necháme procházet proud. DNA se podle své velikosti rozmístí od kladné elektrody až po zápornou. Námi namnožený úsek vytvoří nejsilnější proužek. Toto vyšetření je vždy nutné dělat s negativní kontrolou. To znamená, že do vedlejší jamky umístíme stejně upravenou DNA od pacienta, o kterém víme, že je zdravý. Pomocí tohoto vyšetření můžeme sledovat malé úseky DNA  a nebo specifické přesuny DNA a podobně.

O zatím nejmodernější metodě Next Generation Sequencing (NGS) se lze dočíst například na stránkách Karlsbad Fertility.

Indikace

Preimplantační diagnostika se neprovádí všem párům, důvody jsou hlavně finanční. Pacientům je doporučeno toto vyšetření v těchto případech:

Je nutné uvažovat o správnosti indikace preimplantační diagnostiky u pacientů, u kterých se povedlo oplodnit malý počet embryí.

Výsledek

Při výsledcích preimplantační genetiky je důležité genetikovo vyjádření o stavu chromozomální výbavy embrya a vyjádření embryologa o morfologickém vývoji zárodku. Pokud oba odborníci zhodnotí stav jako vhodný k implantaci je embryo transportováno a nebo zmraženo. Genetik je povinen vyjádřit se ke stavu do 48 hodin. Výsledky genetického vyšetření nejsou ovšem stoprocentní. Je to z několika důvodů. Genetický profil embrya stojí na principu, že všechny buňky v lidském těle obsahují stejnou chromosomovou výbavu. Existují ovšem nemoci nebo stavy, kdy jsou buňky tak zvanými mozaikami. To znamená, že daná porucha se vyskytuje jen v několika procentech buněk. V tomto případě velmi záleží, kterou buňku na preimplantační diagnostiku dostane genetik pod mikroskop. Naštěstí takových to případů není mnoho a genetici s nimi počítají, a proto se o daných chorobách projevujících se u mozajek vyjadřují pouze s určitou pravděpodobností. Další slabinou tohoto vyšetření je, že se testují pouze některé choroby. Pro ty je genetikovo vyjádření celkem přesné, ale o jiných netypických chorobách, nebo o chorobách, pro které není typická jedna nebo malá skupina genových přestaveb, se vyjádří odborník ztěží.

Rizika

Jako největší riziko vnímají odborníci možnost implantace geneticky postiženého embrya. Poté se díky prenatální diagnostice tato vada zjistí a ženě, která podstoupila veškeré procedury asistované reprodukce včetně finančně nákladné preimplantační diagnostiky, je navržen potrat. K těmto chybám nedochází často, ale jsou dány hlavně omezeným portfoliem testovaných choroba také samozřejmě mozaikovitě se projevujícími nemocemi. Existuje nebezpečí poškození rýhujícího se embrya při mikromanipulaci. V tomto případě hraje důležitou roli embryolog, který zaznamená u takovéhoto embrya chybný vývoj po mikromanipulaci a nedovolí jej implantovat i když genetické testy dopadnou dobře.

Financování

Prenatální diagnostika není hrazena z veřejného zdravotního pojištění, a proto si ji pacient musí hradit sám. V některých případech existuje možnost, že pojišťovna část vyšetření uhradí, ale doplatky i v těchto případech dosahují desetitisíců. Cena je nejednotná a záleží na tom kolik sond je při vyšetření použito. Zatím se jedná o tom, aby se preimplantační diagnostika byla zařazena do sazebníku pojišťoven.

Rozdíl preimplantační diagnostika a prenatální diagnostika

Obě tyto metody se zaměřují na odhalení co největšího počtu vad plodu a embrya ještě před narozením. Preimplantační diagnostika je genetické vyšetření, které lze provést jen u párů, které podstoupili IVF. Provádí se metodou FISH a PCR. Prenatální diagnostika se provádí u všech těhotných žen. Každá nastávající maminka je podrobena systému gynekologických kontrol, které nejen sledují její zdravotní stav během těhotenství, ale také se snaží odhalit všechny možné vady plodu.

Metody používající se k prenatální diagnostice jsou:

1) Ultrasonografická kontrola plodu

První ultrasonografické vyšetření je naplánováno na 10.-12. týden těhotenství, krom jiného se vrozené vývojové vady sledují na dvou parametrech.

Druhý ultrazvuk se provádí v 20. gestačním týdnu. Nyní již by měly být odhaleny veškeré možné vrozené vývojové vady. Měří se délky dlouhých kostí končetin. Sledují se rozštěpové vady, srdeční vady uzavření břišní dutiny a další.

Třetí ultrazvuk je naplánován zhruba na 33. týden těhotenství a v tomto období by všechny možné vady měly být dávno odhaleny a pacientce by měl být ponechán čas na rozhodnutí o budoucím postupu. Pokud se na ultrazvuku nějaká vada objeví je to jasná indikace k dalšímu genetickému vyšetření.

2) Laboratorní rozbor krve v druhém  trimestru

Během 16.-18.týdne se matce odebírá krev z periferní žíly a odesílá se na běžný laboratorní screening, který se nazývá triple test. Triple znamená, že se hodnotí tři parametry:

Jakékoli zvýšení nebo snížení těchto hodnot v kombinaci s atypickým ultrasonografickým výsledkem vede k velkému podezření na genetickou poruchu a indikují se další vyšetření jako je amniocentéza nebo odběr choriových klků plodu.

3) Rozbor buněk plodu získaných amniocentézou

Jedná se o invazivní vyšetření, kdy během období od 14. do 24. týdnu je tenkou jehlou za ultrasonografické kontroly odebrána plodová voda. Ta obsahuje odloučené buňky plodu, které jsou poté poslány na genetické vyšetření. Dále se  plodová voda vyšetří i biochemicky, aby se projevili případné metabolické vady dítěte. Výsledky vyšetření jsou běžně k dispozici po dvou až třech týdnech.

4) Rozbor buněk z choriových klků

Další ze série invazivních vyšetření, při kterém lékař pod ultrasonografické kontrolou odebere choriové klky plodu. Ty jsou v pro diagnózu přesnější, ale také riziko odběru je vyšší. Choriové klky jsou mikročásti placenty. Běžně se k tomu to vyšetření přistupuje při nutnosti odběru buněk plodu mezi 11.-14. gestačním týdnem, kdy nám plodová voda neposkytuje dostatek potřebného materiálu.

5) Rozbor krevních buněk plodu odebraných kordocentézou

Kordocentéza je poslední z invazivních metod, která se v našem případě využívá diagnosticky. V jiných případech se dá také použít jako terapeutický výkon (krevní transfůze plodu). Pacientce je  přes břišní stěnu zavedena jehla do pupečníku dítěte. Tím je umožněno lékaři odebrat dítěti v děloze krev a poslat ji na cytogenetické vyšetření.